Interrompiamo il segnale del 70%*.

L’obiettivo della sperimentazione è quello di appurare, tramite uno screening di valutazione dell’adipogenesi, che la combinazione di berberine, catechine e stachioso possa fornire dei dati sperimentali statisticamente significativi rispetto alla combinazione di berberine e catechine e alla combinazione di berberine e stachiosio. Tale valutazione avviene mediante un’analisi statistica che mira a dimostrare che le differenze ottenute tra i diversi campioni siano significative e non casuali.
Il processo di adipogenesi è stato ampiamente studiato in letteratura per identificare composti e sostanze in grado di agire sul processo di formazione degli acidi grassi negli adipociti (1); diverse pubblicazioni scientifiche analizzano l’attività di materie prime, attivi o molecole tramite studi in vitro utilizzando come modello pre-adipociti murini indotti al differenziamento e ne valutano diversi aspetti correlati al processo di adipogenesi. Lo screening iniziale si base sulla quantificazione dei lipidi che si accumulano nelle cellule differenziate tramite colorazione delle gocce lipidiche (2,3). In una seconda fase, vengono analizzati alcuni marcatori specifici dell’adipogenesi o lipogenesi (C/EBPα, PPARγ) tramite l’analisi dell’espressione genica (2,3).

L'obesità è considerata una malattia cronica che predispone a diversi disturbi metabolici, come diabete, malattie cardiovascolari e steatosi epatica (4). Il differenziamento da pre-adipociti ad adipociti (adipogenesi) è un processo chiave nell'aumento della massa grassa che avviene durante l'infanzia e l'adolescenza. Anche in età adulta, l'adipogenesi e l'apoptosi degli adipociti controbilanciano il volume del grasso corporeo in modo dinamico; è stato dimostrato che circa il 10% degli adipociti totali nel corpo dell’adulto si rinnova annualmente (5). Per questi motivi, l'adipogenesi è considerata un obiettivo fondamentale per la prevenzione o il trattamento dell'obesità (6).

Questo processo avviene attraverso una regolazione genica che prevede diverse fasi, principalmente guidata dai recettori ormonali nucleari, come il recettore gamma attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARγ) e le proteine leganti CCAAT/enhancer (C/EBP) α/β/δ (7). Il complesso di C/EBPβ e C/EBPδ dà inizio all'adipogenesi esprimendo PPARγ e C/EBPα (8). Successivamente, C/EBPα dimerizza con C/EBPβ o C/EBPδ, e il complesso guida la fase avanzata dell'adipogenesi (7,9). Inoltre, PPARγ, che viene indotto durante la fase intermedia dell'adipogenesi, porta alla differenziazione e alla maturazione degli adipociti (10). Le espressioni di PPARγ e C/EBPα sono mantenute negli adipociti differenziati per promuovere l'accumulo di lipidi e la secrezione di adipochine (11). Considerando il ruolo chiave di questi marcatori, lo studio e la valutazione della loro

3.1. Linea cellulare e solubilizzazione dei prodotti

La linea di pre-adipociti 3T3-L1 è una delle principali linee cellulari usate per studiare in vitro il differenziamento degli adipociti tramite un processo di differenziamento che richiede l’utilizzo di terreni di coltura specifici. Le cellule 3T3-L1 (3T3-L1 preadipocytes, SP-L1-F Zen-Bio) sono state coltivate in condizioni di completa sterilità e mantenute in incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica (CO2). La lista dei terreni di coltura e dei reagenti usati è riportata in Tabella 3.1.:

3.2. Colorazione con Oil Red O

I pre-adipociti sono stati seminati in piastra a 12 pozzetti fino al raggiungimento della confluenza e successivamente si è proceduto con il protocollo di differenziamento. Le cellule sono state trattate con le concentrazioni di prodotto risultate non citotossiche dal precedente test di vitalità cellulare e con il controllo positivo (Catechina). Sono stati mantenuti un controllo di cellule non differenziate e un controllo di cellule differenziate e non trattate. Al termine del trattamento, si è proceduto con la fissazione in formalina, lavaggio e successiva colorazione con la soluzione Oil Red O (Merck) per 20 min.
Le gocce lipidiche sono state visualizzate al microscopio e l’accumulo lipidico è stato quantificato in seguito ad estrazione con isopropanolo per 5 min e lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 492 nm.

3.3. Valutazione dell’espressione genica tramite Real-Time

L'espressione genica del marcatore PPARγ, coinvolto nelle prime fasi di adipogenesi, nella regolazione della sensibilità all’insulina e per la lipogenesi, è stata studiata mediante tecnica qRT-PCR su cellule 3T3-L1. La Real-time PCR è una tecnica che permette di valutare la variazione dell'espressione genica di un target specifico mediante estrazione del RNA totale, trascrizione inversa in cDNA e successiva amplificazione e quantificazione mediante sonde fluorescenti che si legano al DNA di nuova sintesi consentendo la quantificazione del prodotto amplificato ad ogni ciclo di reazione. La fluorescenza emessa è direttamente proporzionale alla quantità di amplificato di interesse.
Per questo test le cellule 3T3-L1 sono state seminate in modo omogeneo in piastre da 12 pozzetti in base alle indicazioni del protocollo di differenziamento. Al termine, il trattamento è stato eseguito per 96 h, cambiando il terreno ogni 48h. Successivamente, il trattamento è stato rimosso e le cellule sono state mantenute in terreno di mantenimento per ulteriori 24 h.
Per la valutazione dell'espressione genica, le molecole di RNA cellulare totale sono state estratte dalle cellule con il kit di isolamento dell'RNA (Qiagen) secondo il protocollo del produttore. Successivamente, la concentrazione di RNA totale estratto è stata quantificata utilizzando MultiSkanGo (Thermo Fisher) ed è stata effettuata una trascrizione inversa del RNA totale in cDNA utilizzando il kit di sintesi di cDNA (Bio-Rad).
Le condizioni di reazione consistono nella denaturazione del cDNA a doppio filamento, nell’annealing dei primer e nell'estensione del nuovo filamento sintetizzato; le ultime due fasi sono state ripetute per 39 cicli consecutivi. I livelli di espressione dell'RNA sono stati normalizzati al livello di espressione di GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Lo strumento utilizzato per l'analisi è CFX (Bio-Rad) ei dati sono stati analizzati utilizzando il software CFX Manager.

I risultati ottenuti sono riportati in forma grafica e in tabelle contenenti i valori relativi alla vitalità cellulare ed all’espressione genica di marcatori coinvolti nelle fasi di differenziamento degli adipociti, in seguito a trattamento con i prodotti da testare rispetto a cellule non trattate.
L'analisi statistica è stata eseguita con il metodo ONE WAY-ANOVA seguito dal test Bonferroni per confronti multipli utilizzando il software GraphPad Prism version 10.5.0 software (GraphPad Software, Inc).

4.1. Valutazione della vitalità cellulare

Cellule 3T3-L1 sono state trattate (24h) con diverse concentrazioni dei prodotti selezionati allo scopo di identificare quelle che non causino una riduzione della respirazione cellulare (intesa come vitalità) superiore al 30%.
In Figura 4.1. e in Tabella 4.1. sono riportati i grafici e i dati corrispettivi, espressi in percentuale rispetto al controllo (cellule non trattate), della vitalità cellulare dopo 24h di trattamento.

Figura 4.1. Analisi della vitalità cellulare espressa in percentuale rispetto al controllo non trattato (0) dopo 24h di trattamento con i prodotti testati partendo dallo stock 100% e successive diluizioni.

Dopo 24h di trattamento con la miscela di attivi si osserva che il prodotto BOOSTER UP no the verde STACHIOSIO BEREBERINA mostra una maggiore riduzione della vitalità cellulare a partire dalla concentrazione pari al 6,25% rispetto agli altri due prodotti analizzati. Dalla tabella riassuntiva dei risultati si osserva infatti che i prodotti BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE ed EXXL FAST SLIM BERBERINA THE VERDE risultano essere citotossici, portando ad una riduzione della vitalità cellulare di circa il 20%, a partire da concentrazioni maggiori, più precisamente dal 75% per il prodotto BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE e dal 50% per il prodotto EXXL FAST SLIM BERBERINA THE VERDE. Si può inoltre notare che fino alla concentrazione 100%, il prodotto BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE mostra una vitalità cellulare stabile a circa il 70%, a differenza degli altri due prodotti che mostrano una riduzione della vitalità dose-dipendente. In base a queste considerazioni, si è deciso di trattare le cellule per la prova di colorazione degli acidi grassi a partire dalla concentrazione 12,5%.

4.2. Valutazione del contenuto lipidico

Al fine di verificare l’effetto sul processo di adipogenesi, i pre-adipociti sono stati indotti a differenziare e successivamente trattati con i diversi prodotti e con il controllo positivo (Catechina), una molecola con una nota attività a livello di riduzione dell’accumulo di lipidi (12). Il contenuto lipidico è stato successivamente marcato con la soluzione di Oil Red (Merck).

In Figura 4.2. sono riportate immagini rappresentative di adipociti differenziati e trattati con i prodotti da testare; visivamente è apprezzabile una diminuzione del contenuto lipidico nei campioni trattati con il controllo positivo rispetto al controllo non trattato. È evidente anche il corretto differenziamento dei pre-adipociti in adipociti, come dimostrato dalla presenza di gocce lipidiche nel campione differenziato rispetto al campione di pre-adipociti.

La quantificazione tramite lettura spettrofotometrica mostra come non siano visibili variazioni statisticamente significative del contenuto di lipidi all’interno delle cellule in seguito a 24h di trattamento con i prodotti da testare, mantenendo valori paragonabili al controllo.

Tabella 4.3. Quantificazione del contenuto lipidico dopo 24 h di trattamento con i prodotti testati e con il controllo positivo. Valori con **** p ≤ 0,001, con ***p ≤ 0,01 sono considerati statisticamente significativi rispetto al CTRL.

4.3. Valutazione dell’espressione genica tramite RT-PCR

L’eventuale capacità di modulare l’espressione genica di uno dei marcatori coinvolti nel processo di adipogenesi, lipogenesi e del metabolismo del glucosio è stata analizzata tramite la tecnica RT-PCR (Real-Time PCR).

Diversi fattori di trascrizione, come quelli appartenenti alle famiglie C/EBP e PPAR, sono espressi durante il processo di differenziamento e di lipolisi degli adipociti; è stato quindi valutato se il trattamento con i diversi prodotti da testare possa influire l’espressione del marker PPARg, e quindi del metabolismo degli acidi grassi e della lipolisi.

Gli adipociti differenziati sono stati trattati per 96 h, cambiando il trattamento dopo 48h. Successivamente, i campioni sono stati processati per l’esecuzione dell’analisi di espressione genica ed i valori riportati in Figura 4.4. evidenziano come il trattamento con i prodotti
BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE e EXXL FAST SLIM BERBERINA THE VERDE porti a una netta diminuzione dell’espressione di PPARγ, confrontati non solo con il controllo non trattato ma anche rispetto al prodotto senza the verde. Infatti, confrontando le stesse concentrazioni dei due prodotti con il prodotto P1 si osserva che l’espressione diminuisce di circa il 30% per tutte le condizioni testate e che questa diminuzione è statisticamente significativa.

Come mostrato, PPARγ aumenta in adipociti differenziati (Ctrl) rispetto al campione di pre-adipociti (C non diff.), confermando il suo ruolo nelle prime fasi dell’adipogenesi; inoltre, il trattamento con il controllo positivo risulta essere altamente significativo con un’espressione del marker di circa il 50%, confermando la corretta esecuzione del processo di differenziamento.

Tabella 4.4. Analisi quantitativa del marcatore PPARg dopo trattamento con i prodotti in esame. CTRL: cellule differenziate e non trattate; C+ Magnolol: cellule differenziate e trattate con il controllo positivo Magnololo; P1: cellule differenziate e trattate con BOOSTER UP no the verde STACHIOSIO BERBERINA; P2: cellule differenziate e trattate con BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE; P3: cellule differenziate e trattate con EXXL FAST SLIM BERBERINA THE VERDE. (n=3; replicati=2).

Tabella 4.5. Analisi quantitativa del marcatore PPARg dopo trattamento con i prodotti in esame. CTRL: cellule differenziate e non trattate; P2: cellule differenziate e trattate con BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE; P3: cellule differenziate e trattate con EXXL FAST SLIM BERBERINA THE VERDE. (n=3; replicati=2).

La Figura 4.5. mostra invece i risultati paragonando l’effetto del trattamento con BOOSTER UP STACHIOSIO BERBERINA THE VERDE rispetto al campione trattato con EXXL FAST SLIM BERBERINA THE VERDE; è evidente come il primo prodotto sia maggiormente efficace nel ridurre l’espressione del marker di adipogenesi alla concentrazione minore con un’espressione pari al 10%.